Mito 1.2: La ingeniería genética es precisa y sus resultados son predecibles

Mito: La ingeniería genética es precisa y sus resultados son predecibles

Realidad: La ingeniería genética es tosca e imprecisa, y sus resultados son impredecibles

El mito en unas líneas: 

Los defensores de la ingeniería genética sostienen que la modificación genética es una técnica precisa que permite que los genes que codifican un rasgo de interés se inserten en la planta huésped sin que haya efectos inesperados, pero la ingeniería genética y los métodos de cultivo celular asociados son en realidad imprecisos y altamente mutagénicos. Estas técnicas conducen a cambios impredecibles en el ADN, las proteínas, y la composición bioquímica del cultivo modificado resultante, lo cual puede dar lugar a efectos tóxicos o alergénicos inesperados y a alteraciones nutricionales, así como a otros efectos impredecibles sobre el medio ambiente.

Los defensores de la ingeniería genética sostienen que es una técnica precisa que permite que los genes que codifican un rasgo de interés se inserten en la planta huésped sin que haya efectos inesperados.

El primer paso para el desarrollo de una planta MG (modificada genéticamente) - aislar el gen de interés, cortarlo y pegarlo para formar el cassette génico MG en el laboratorio - sí que es preciso, pero los pasos siguientes no. En concreto, el proceso de inserción de un cassette génico modificado genéticamente en el ADN de la célula vegetal es tosco, incontrolado e impreciso, y provoca mutaciones - cambios hereditarios - en la secuencia de ADN[1]. Estas mutaciones pueden alterar el funcionamiento de los genes propios de la planta de una manera impredecible y potencialmente perjudicial.[2 3] Otros procedimientos asociados al desarrollo de cultivos MG, incluyendo el cultivo de tejidos, también provocan mutaciones.[1]

Aparte de las mutaciones, existen otras maneras en las que el proceso de modificación genética puede dar lugar a efectos inesperados: los defensores de los cultivos MG describen una visión simplista de la ingeniería genética, basada en una comprensión ingenua y anticuada de la organización de los genes en el ADN y su funcionamiento, dando a entender que se puede insertar un sólo gen con una precisión milimétrica y que la inserción tendrá un efecto único y predecible sobre el organismo y su entorno.

Sin embargo, la manipulación de uno o dos genes no produce simplemente uno o dos rasgos de interés, sino que un sólo cambio en el ADN puede dar lugar a múltiples cambios en el organismo[2 4], conocidos como efectos pleiotrópicos. Esto ocurre debido a que los genes no actúan como unidades aisladas, sino que interaccionan unos con otros y están regulados por una red altamente compleja formada por múltiples capas de procesos genéticos y epigenéticos (los efectos epigenéticos son cambios hereditarios en la expresión génica o la célula, provocados por mecanismos que no se encuentran en la secuencia de ADN). Los componentes del gen MG, así como las funciones y estructuras que los genes MG confieren al organismo, interaccionan con otras unidades funcionales presentes en este.

Debido a la diversidad de estas interacciones, y a que hasta el ser vivo más simple es extremadamente complejo, es imposible predecir los impactos que incluso un único gen MG podría tener en el organismo. La complejidad de los sistemas vivos hace que sea aún más complicado predecir el impacto de un OMG dado en su entorno.

En resumen, durante el proceso de modificación genética se dan mutaciones accidentales e incontroladas e interacciones complejas a múltiples niveles dentro del organismo, lo cual origina cambios impredecibles como resultado de la inserción de un sólo gen nuevo.

Una modificación genética aparentemente simple puede dar lugar a cambios inesperados y potencialmente perjudiciales en el OMG resultante y los alimentos derivados de este. Estos cambios podrían incluir alteraciones en el contenido nutricional del alimento, efectos tóxicos y alergénicos, disminución del rendimiento del cultivo, o emergencia y propagación de características que dañen el medio ambiente.

Es poco probable que los efectos perjudiciales sean detectados en análisis tan pobres como los que se realizan en los procesos de autorización de los OMG. Incluso en los casos en que se detectan cambios, estos a menudo se descartan por considerarse irrelevantes, por lo que no se realizan estudios posteriores.

Estos cambios inesperados son especialmente peligrosos, ya que la liberación de OMG en el medio ambiente es irreversible. Hasta la peor contaminación química disminuye a lo largo del tiempo, cuando los mecanismos físicos y biológicos degradan el contaminante. Pero los OMG son organismos vivos. Una vez se liberan en un ecosistema, no se degradan, y no pueden volverse a retirar, sino que se dispersarán y multiplicarán, transmitiendo sus genes MG a las generaciones futuras. Cada nueva generación crea oportunidades nuevas para que el OMG interaccione con otros organismos y el entorno, lo cual genera nuevos efectos secundarios impredecibles.

El proceso de modificación genética es altamente mutagénico

El proceso de desarrollo de una planta MG es altamente mutagénico, lo que significa que daña el ADN, dando lugar a cambios en el genoma. Las mutaciones pueden ser beneficiosas o perjudiciales. Muy raramente, una mutación específica puede beneficiar el funcionamiento del organismo. Estos cambios suponen la base de la evolución por selección natural. Es mucho más frecuente que las mutaciones perjudiquen al organismo, originando, por ejemplo, defectos de nacimiento o cáncer.

El proceso de modificación genética provoca tres tipos de efectos mutagénicos, que se detallan a continuación. [1 2]

Mutagénesis insercional

La modificación genética o el uso de ingeniería genética en un organismo siempre implica la inserción de un cassette génico externo en el genoma (ADN) del organismo receptor. El proceso de inserción no está controlado, ya que el sitio de inserción del gen externo es aleatorio. La inserción del cassette génico MG interrumpe la secuencia normal de las “letras” del código genético en el ADN de la planta, dando lugar a lo que se conoce como mutagénesis insercional. Esto puede ocurrir de diferentes maneras:

El gen MG puede insertarse en medio de uno de los genes propios de la planta. Esto suele bloquear la expresión del gen, destruyendo su función (esta inactivación se conoce como "knock out"). De forma menos frecuente, el evento de inserción alterará la estructura del gen de la planta y la estructura y función de la proteína que codifica.

El gen MG puede insertarse en una región del ADN de la planta que controle la expresión de uno o más genes en la planta huésped, aumentando o reduciendo de forma artificial su nivel de expresión.

Incluso en los casos en los que el gen MG no se inserta directamente en un gen de la planta huésped o sus elementos de control, su mera presencia en una región del ADN de la planta huésped en la que existen genes activos puede alterar el patrón normal de funcionamiento de estos - es decir, el nivel al que se activa un determinado gen. De esta forma, puede alterar el equilibrio de los productos proteicos procedentes de estos genes. Las proteínas reguladoras podrían unirse al gen insertado en lugar de a los elementos de control del ADN de la planta huésped, lo que perturbaría el nivel y patrón de expresión génica habitual.

Dado que la inserción del gen MG es un proceso impreciso e incontrolado, no hay forma de predecir o controlar cuáles de los genes de la planta se verán influenciados y de qué manera.

Mutaciones en todo el genoma

En la mayoría de los casos, el proceso de inserción no es nada limpio. Además de la inserción deseada, pueden insertarse fragmentos de ADN del cassette génico MG en sitios múltiples aleatorios del genoma de la planta huésped. Cada una de estas inserciones accidentales es un evento mutacional que puede alterar o destruir la función de otros genes así como del gen MG completo, de la forma que se describió en el apartado "Mutagénesis insercional".

Se estima que la probabilidad de que un evento de inserción dado altere el funcionamiento de un gen es del 53-66% [1]. Por tanto, si el proceso de modificación genética tiene como resultado una inserción principal y dos o tres inserciones accidentales, es probable que al menos dos de los genes de la planta se vean alterados.

Los estudios realizados indican que el proceso de modificación genética también puede provocar otros tipos de mutación - reordenaciones y deleciones del ADN de la planta, en especial en el sitio de inserción del cassette génico MG [1] - lo cuál podría comprometer el funcionamiento de genes importantes para la planta.

Mutaciones causadas por el cultivo de tejidos

El proceso de modificación genética incluye tres pasos en los que las células de la planta huésped se cultivan mediante un proceso conocido como cultivo celular o cultivo de tejidos. Estos pasos son:

  1. La inserción inicial del cassette génico MG en las células de la planta huésped
  2. La selección de células vegetales en las que el cassette génico MG se ha insertado con éxito
  3. El paso de células vegetales MG a plántulas con raíces y hojas, con ayuda de hormonas vegetales.

Los métodos del cultivo de tejidos son en sí altamente mutagénicos, y causan cientos o incluso miles de mutaciones en el ADN de la célula huésped.[1 2]Dado que el cultivo de tejidos es esencial para los tres pasos descritos anteriormente y que estos pasos son centrales para la metodología de la ingeniería genética, existen numerosas oportunidades en las que el cultivo de tejidos puede inducir mutaciones en las células vegetales.

En el caso de plantas que se propagan vegetativamente (es decir, no a través de semillas sino de tubérculos o esquejes), como la patata, todos los tipos de mutaciones derivados del proceso de transformación en una planta MG dada estarán presentes en el cultivo que finalmente se comercialice.

En el caso de la soja, el maíz, el algodón y el aceite de colza, pueden llevarse a cabo retrocruzamientos entre la planta MG y la variedad parental no-MG para lograr una mayor similitud genética. Este retrocruzamiento permite eliminar muchas de las mutaciones ocurridas durante el proceso de transformación, aunque no todas.

Sin embargo, debido a que la mutación podría haberse dado inicialmente en cientos de genes durante el proceso de inserción del cassette génico MG y el cultivo de tejidos, existe un riesgo significativo de que puedan verse dañados uno o varios genes cruciales para alguna característica importante, como la resistencia a enfermedades o plagas. Otro ejemplo podría ser el de un gen que participase en el control de reacciones bioquímicas en la planta, y que al ser dañado haría a la planta alergénica o tóxica, o alteraría su valor nutricional.

El biotecnólogo no sería capaz de detectar y eliminar muchas mutaciones perjudiciales de este tipo, ya que sus efectos no serían obvios bajo las condiciones del proceso de desarrollo de la variedad. Sin embargo, estas mutaciones seguirían estando presentes en el cultivo comercializado y podrían originar problemas. Por ejemplo, la variedad parental no-MG podría contener un gen que confiriera resistencia a un insecto plaga. En el laboratorio y el invernadero donde se desarrolla el cultivo MG ese insecto no estaría presente, por lo que los investigadores no tendrían manera de advertir el cambio. Sólo cuando la variedad se hubiera comercializado se podría descubrir que ya no es capaz de resistir el insecto plaga.

Cómo la modificación genética selecciona mutaciones en el organismo huésped

El cassette génico MG que se inserta en el ADN de la planta huésped (paso 1 en el anterior apartado, 3. "Mutaciones provocadas por el cultivo de tejidos"), incluye normalmente un gen marcador seleccionable. Lo más común es que el gen marcador confiera la resistencia a un antibiótico a aquellas células que incorporen el cassette génico MG y expresen los genes que este incluye. Tal y como se desarrolló en el Mito 1.1., el gen marcador de resistencia a antibiótico permite al investigador identificar qué células vegetales han incorporado adecuadamente el cassette génico MG en su genoma. Otra opción, cuando el gen MG confiere tolerancia a un herbicida, es usar el propio gen para seleccionar las plantas transformadas.

Es importante señalar que la selección tanto por antibióticos como por herbicida depende de la expresión del gen marcador. Esta expresión es necesaria para hacer a la planta resistente al antibiótico o tolerante al tratamiento con el herbicida. Si el gen no expresa su proteína, no conferirá resistencia al antibiótico o herbicida, y la célula morirá al ser expuesta.

No todas las regiones del ADN de la célula vegetal permiten que se dé el proceso de expresión génica. De hecho, la inmensa mayoría de regiones del ADN de cualquier célula son no-permisivas. Cualquier gen presente en una de estas regiones del genoma de la planta será silenciado - esto es, no se expresará. Dado que el proceso de inserción del cassette génico MG (que contiene el gen(es) MG de interés y cualquier gen marcador de resistencia a antibióticos asociado) es esencialmente aleatorio, la mayoría de las inserciones tendrán lugar en regiones no-permisivas del ADN de la célula vegetal, y no darán lugar a que se exprese ni el gen marcador ni el gen MG. Estas células no sobrevivirán la exposición al antibiótico o herbicida. Sólo cuando el cassette génico MG, incluyendo el gen marcador de resistencia a antibióticos, sea insertado en una región funcionalmente permisiva del ADN de la célula vegetal, podrá la célula expresar el gen marcador y sobrevivir la exposición al antibiótico o herbicida.

Las regiones permisivas son áreas del ADN en las que se encuentran y están activos genes o elementos de control importantes para el funcionamiento de las células de la planta receptora. Por tanto, la utilización de resistencias a antibióticos o herbicidas seleccionará células en las que el cassette génico MG se haya insertado en una región permisiva del ADN. Dado que estas son también las regiones que contienen genes y elementos de control importantes para el funcionamiento de la planta receptora, las inserciones en estas regiones implican una probabilidad mucho mayor de dañar la expresión de genes importantes para la función celular e incluso para la supervivencia de la célula vegetal receptora.

En resumen, la selección de inserciones del gen MG durante los procedimientos de transformación maximiza la probabilidad de que la incorporación del gen MG dañe uno o más genes activos e importantes para el funcionamiento de la planta huésped.

De este análisis de los mecanismos por los que la modificación genética puede causar mutaciones concluimos que no es el proceso científico, elegante y milimétricamente calculado que sostienen sus defensores, sino que depende en gran medida de la suerte para conseguir los resultados deseados sin que haya daños significativos. También concluimos que es poco sensato comercializar variedades MG sin un análisis pormenorizado de sus posibles efectos perjudiciales sobre la salud y el medio ambiente.

¿Se está volviendo más precisa la ingeniería genética?

Se han desarrollado tecnologías que pretenden dirigir la inserción de un gen MG a un sitio predeterminado dentro del ADN de la planta, en un esfuerzo de obtener un resultado más predecible y evitar las complicaciones que pueden resultar de mutaciones insercionales aleatorias.[5 6 7 8 9 10]

Algunas de estas técnicas usan nucleasas o "tijeras genómicas", que permiten cortar el ADN e insertar ADN nuevo en cualquier posición en el cromosoma. Las más populares de estas tijeras genómicas son los TALENs (transcription activator-like effector nucleases, nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción), ZFNs (nucleasas con dominios de dedos de zinc), y más recientemente CRISPR - Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).

Estas tijeras genómicas combinan una unidad capaz de reconocer regiones específicas del ADN y una enzima que corta ambas hebras de ADN en una secuencia definida por el investigador. Cuando la célula detecta que se ha producido este corte en la doble hebra de ADN, estimula la maquinaria celular de reparación.

Hay dos resultados posibles. El primero, que al permitir que se dé la reparación y que los extremos cortados del ADN vuelvan a unirse (un proceso conocido como "recombinación no homóloga"), se introduzca una mutación en el sitio de corte de las tijeras genómicas. Esto se debe a que la recombinación no homóloga no es perfecta, y en la mayoría de los casos se pierden bases de los extremos de la cadena de ADN durante el proceso de unión.

La segunda opción consiste en que, a la vez que el gen de la tijera genómica se introduce en la célula vegetal, el investigador también pueda introducir una molécula diferente de ADN que tenga los mismos componentes que la región que está tratando de modificar en el genoma huésped, pero que además contenga un gen que dé lugar al rasgo adicional deseado. El gen artificial introducido puede alinearse con la región correspondiente del ADN de la célula huésped. En ocasiones, la célula utilizará esta segunda molécula de ADN introducida como guía para reparar la doble hebra de ADN en un proceso conocido como "recombinación homóloga". El resultado final es la reparación de la doble hebra de ADN, pero con la incorporación del gen modificado en el sitio de interés.

Usando estos métodos, se pueden inactivar (silenciar) o mutar genes, o se puede insertar ADN, incluyendo genes completos.

Sus defensores sostienen que estas tecnologías ofrecen una "edición dirigida del genoma".[11] Sin embargo, estos métodos de transformación no son infalibles. Dos estudios observaron que los ZFNs provocaban modificaciones genómicas accidentales en sitios distintos al objetivo en líneas celulares humanas.[12 13] Una palabra más simple para designar "modificaciones en sitios distintos al objetivo" es "mutaciones". Es decir, estas técnicas pueden provocar mutaciones accidentales en otros lugares del genoma, dando lugar a una serie de efectos secundarios potencialmente perjudiciales. En otro estudio que usaba células humanas, se demostró que CRISPR provocaba mutaciones inesperadas en diversas regiones del genoma.[14]

Los biotecnólogos conocen tan sólo una pequeña parte del funcionamiento del genoma de cualquier especie y sobre el funcionamiento genético, bioquímico y celular de las especies que utilizamos como cultivos. Esto significa que incluso en el caso de que seleccionaran un sitio de inserción que piensan va a ser seguro, dicha inserción podría provocar una serie de efectos inesperados, como alteraciones en la expresión génica o en la función de la proteína(s) codificada(s) por el gen.

Incluso si no hubiera ninguna alteración a nivel del gen, podría haber perturbaciones a nivel de la proteína que el gen codifica. Por ejemplo, una planta podría tener una enzima que normalmente es inhibida por un herbicida, lo que significa que la planta morirá si este herbicida se aplica. Si la planta es modificada genéticamente para alterar esta enzima y que esta no se inhiba por acción del herbicida (tolerancia al herbicida), podrían darse efectos inesperados. Las enzimas no son totalmente específicas. Si la actividad de la enzima cambia, la bioquímica de la planta podría verse alterada en el proceso, causando reacciones químicas desconocidas con consecuencias impredecibles.

Es más, dado que el cultivo de tejidos sigue siendo necesario con estos métodos de inserción dirigida, los efectos mutagénicos del cultivo de tejidos continuarían siendo una fuente importante de efectos secundarios accidentales perjudiciales.

Estos efectos podrían incluir:

  • Toxinas o alérgenos inesperados, o alteraciones del valor nutricional
  • Reducción de la capacidad del cultivo MG para resistir enfermedades, plagas, sequía u otros tipos de estrés
  • Reducción de la productividad o el vigor
  • Efectos medioambientales inesperados, como un aumento de la invasividad.

Según un periódico alemán, las plantas obtenidas mediante estas tecnologías ya están siendo cultivadas en invernaderos. El instituto independiente de investigación Testbiotech declara que se desconoce si alguna de las plantas ha sido liberada al medio ambiente, añadiendo "Existe, sin embargo, una clara falta de regulación que asegure que estas plantas, que son organismos genéticamente modificados, sean sometidas a un análisis de riesgos."[15]

RTDS: ¿modificación genética o no?

Las empresas biotecnológicas BASF y Cibus han mejorado algunas variedades de colza con una técnica conocida como RTDS (Rapid Trait Development System, Sistema de Desarrollo Rápido de Caracteres Genéticos).[16] Según Cibus, el RTDS es un método que altera un gen objetivo utilizando el propio sistema de reparación de la célula para modificar específicamente la secuencia génica in situ, y no implica la inserción de genes externos o secuencias génicas de control de la expresión. El Oligonucleótido de Reparación Génica (GRON) que lleva a cabo este cambio es un oligonucleótido sintetizado químicamente,[17] una hebra simple y corta de ADN y/o una molécula de ARN.

Cibus comercializa sus cultivos RTDS como no transgénicos y producidos "sin la inserción de ADN extraño en las plantas". La empresa añade que los cultivos desarrollados utilizando este método son "más rápidos de comercializar con menor gasto regulatorio".[16] Cibus declara que el método RTDS es "completamente natural", no tiene "ninguno de los riesgos sanitarios y medioambientales asociados con la mejora transgénica" y presenta "resultados predecibles en las plantas".[18]

Sin embargo, la modificación genética es un proceso, y su definición no depende del origen del material genético insertado. Los cultivos creados mediante RTDS pueden y deberían ser descritos como OMG, dado que el RTDS altera el genoma en formas que no ocurrirían de forma natural mediante la mejora convencional o recombinación genética. El hecho de que no se inserte ningún ADN externo en el genoma de la planta receptora es irrelevante.

Además, el RTDS sigue implicando la utilización de cultivos de tejidos, que introducen mutaciones en todo el genoma. Algunas o todas estas mutaciones (todas en el caso de plantas propagadas vegetativamente, como las patatas) estarán presentes en el producto comercializado final. Además, el proceso RTDS implicará inevitablemente efectos en lugares distintos al objetivo. La intención del proceso RTDS es actuar de forma dirigida, pero esta técnica es nueva y aún no se han llevado a cabo investigaciones que puedan estudiar la frecuencia y extensión de sus efectos no específicos. En este caso podría aplicarse el viejo dicho: "Que no haya pruebas del daño no significa que no haya daño".

Se necesitan muchos estudios para demostrar la seguridad y eficacia del proceso RTDS, y la medida en la que las alteraciones accidentales se dan en lugares del genoma que no son la región objetivo. Por ejemplo, un tipo importante de estudios que deberán llevarse a cabo es la secuenciación del genoma completo de OMG RTDS. También haría falta realizar un análisis estructural y funcional de las proteínas presentes en los OMG RTDS (proteómica) así como el análisis de los metabolitos presentes (metabolómica). Paralelamente, se debería estudiar el rendimiento funcional de estos OMG RTDS. Es necesario investigar el rendimiento agronómico, el impacto sobre el medio ambiente y la calidad y seguridad de los alimentos derivados de estos OMG obtenidos por RTDS, incluyendo estudios toxicológicos de alimentación a largo plazo.

El cambio de incluso un solo gen, ya codifique una enzima, una proteína estructural, una hormona peptídica o una proteína reguladora, puede causar alteraciones funcionales o estructurales accidentales a nivel de la célula o del organismo en su conjunto.

El RTDS es un proceso de modificación genética, aunque sea más dirigido que otras técnicas de ADN recombinante. Cualquier cultivo u otro organismo producido de esta manera deberá ser tratado exactamente de la misma manera que los cultivos alterados usando técnicas de ADN recombinante a la vieja usanza, es decir, con una evaluación pormenorizada de su funcionalidad, utilidad y seguridad.

"Nuevo" no significa necesariamente "mejor" o "más seguro". El RTDS y los otros métodos anteriormente descritos son nuevos y fueron diseñados para ser más específicos. Esta es una intención loable, pero es necesario recopilar pruebas empíricas sobre la eficacia y seguridad de estas nuevas técnicas.

Resulta interesante señalar que la empresa biotecnológica Cibus, en su material publicitario sobre el método RTDS, reconoce la imprecisión de la modificación genética estándar mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante.[18]

Conclusión: 

La ingeniería genética y los métodos de cultivo de tejidos asociados son imprecisos y altamente mutagénicos. Conducen a cambios impredecibles en el ADN, proteínas y composición bioquímica de los OMG resultantes, lo cual puede conducir a efectos tóxicos o alergénicos impredecibles y a alteraciones nutricionales, así como a efectos inesperados sobre el medio ambiente.

Referencias: 

1. Latham JR, Wilson AK, Steinbrecher RA. The mutational consequences of plant transformation. J Biomed Biotechnol. 2006;2006:1–7. doi:10.1155/JBB/2006/25376.

2. Wilson AK, Latham JR, Steinbrecher RA. Transformation-induced mutations in transgenic plants: Analysis and biosafety implications. Biotechnol Genet Eng Rev. 2006;23:209–238.

3. Schubert D. A different perspective on GM food. Nat Biotechnol. 2002;20:969. doi:10.1038/nbt1002-969.

4. Pusztai A, Bardocz S, Ewen SWB. Genetically modified foods: Potential human health effects. In: D’Mello JPF, ed. Food Safety: Contaminants and Toxins. Wallingford, Oxon: CABI Publishing; 2003:347–372. Disponible en: http://www.leopold.iastate.edu/news/pastevents/pusztai/0851996078Ch16.pdf.

5 Kumar S, Fladung M. Controlling transgene integration in plants. Trends Plant Sci. 2001;6:155–9.

6. Ow DW. Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era. Plant Mol Biol. 2002;48:183-200.

7. Li Z, Moon BP, Xing A, et al. Stacking multiple transgenes at a selected genomic site via repeated recombinase-mediated DNA cassette exchanges. Plant Physiol. 2010;154:622-31. doi:10.1104/pp.110.160093.

8. Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, et al. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature. 2009;459(7245):437-41. doi:10.1038/nature07992.

9. Townsend JA, Wright DA, Winfrey RJ, et al. High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases. Nature. 2009;459(7245):442-5. doi:10.1038/nature07845.

10. Shen H. CRISPR technology leaps from lab to industry. Nature. 2013. doi:10.1038/nature.2013.14299.

11. Wood AJ, Lo T-W, Zeitler B, et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 2011;333(6040):307. doi:10.1126/science.1207773.

12. Pattanayak V, Ramirez CL, Joung JK, Liu DR. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nat Methods. 2011;8(9):765-770. doi:10.1038/nmeth.1670.

13. Gabriel R, Lombardo A, Arens A, et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 2011;29(9):816-823. doi:10.1038/nbt.1948.

14. Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826. doi:10.1038/nbt.2623.

15. Then C. Free trade for “high-risk biotech”? Future of genetically engineered organisms, new synthetic genome technologies and the planned free trade agreement TTIP – a critical assessment. Munich, Alemania: Testbiotech; 2013. Disponible en: http://www.testbiotech.org/sites/default/files/Testbiotech_Future_Biotech.pdf.

16. Cibus. BASF and Cibus achieve development milestone in CLEARFIELD® production system [comunicado de prensa]. Sin fecha. Disponible en: http://www.cibus.com/press/press012709.php.

17. Cibus. What is RTDSTM? The Rapid Trait Development System in brief. 2013. Disponible en: http://www.cibus.com/rtds.php.

18. Cibus. The evolution of plant breeding: RTDSTM versus other technologies. Sin fecha. Disponible en: http://www.cibus.com/pdfs/RtdsSketch4_LoRes.pdf.

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